Metoda Real-Time PCR

Metoda Real-Time PCR - informacje podstawowe

Łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction – PCR) to metoda pozwalająca na powielanie konkretnych odcinków DNA w warunkach laboratoryjnych. Została odkryta przez Kary’ego Mullisa w 1980 roku i od tego czasu opracowano wiele jej ulepszeń i modyfikacji. Jedną z takich odmian jest tzw. real-time PCR, czyli inaczej PCR w czasie rzeczywistym. W metodzie PCR następują po sobie cyklicznie kolejne etapy przetwarzania (ogrzewania i oziębiania) materiału genetycznego próbki – denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie łańcucha. Efektem jest selektywnie zamplifikowany (powielony) poszukiwany odcinek kwasu nukleinowego.

Real-time PCR umożliwia jednoczesne namnażanie DNA oraz monitorowanie ilości produktów (amplikonów) powstających podczas kolejnych cykli poprzez pomiar fluorescencji wydzielonej podczas przyłączania się fluoryzujących sond do targetowego odcinka DNA.  Wzrost ilości kopii DNA targetowego w czasie rzeczywistym śledzimy bezpośrednio na ekranie urządzenia (tzw. termocyklera) lub podłączonego do niego komputera.

Teoretycznie, po zakończeniu każdego cyklu reakcji PCR, liczba cząsteczek amplikonu powinna ulec podwojeniu, jednak po fazie początkowej, charakteryzującej się logarytmicznym wzrostem, następuje tzw. faza eksploatacyjna (faza plateau) będąca wynikiem zużywania się substratów w mieszaninie reakcyjnej. Wizualnie więc, wynik dodatni badania, mający odzwierciedlenie w intensywności wytworzonej fluorescencji, obserwujemy na ekranie komputera/urządzenia w postaci krzywej przybierającej zwykle kształt funkcji logarytmicznej.

Wykorzystanie praktyczne tej metody ewoluowało na przestrzeni lat, pozwalając na „wyjście” z laboratoriów naukowych i badawczych, coraz bardziej w kierunku laboratoriów kontroli jakości produktu i produkcji. Metoda Real-time PCR może być wykorzystywana do wykonywania analiz na obecność obcych (zwykle niepożądanych) fragmentów DNA, np. pochodzących z bakterii, wirusów czy grzybów w badanej próbie, a także ich ilościowego oznaczania.

Metoda z powodzeniem została zaimplementowana na rynek produkcji żywności, zwłaszcza w sektorze produktów o krótkim terminie przydatności do spożycia. Stało się tak dlatego, że największym zyskiem z wykorzystania metody PCR jest szybkość uzyskania wyników.

Wysoka czułość metody oraz zautomatyzowanie części procesu oznaczania mikroorganizmów w badanych próbkach żywności zwiększa zainteresowanie tym rozwiązaniem w laboratoriach kontroli jakości, odpowiedzialnych za jak najszybsze i wiarygodne decydowanie o zwolnieniu produktu na rynek.

Nasza firma od wielu lat wdraża metodę Real-Time PCR wśród rodzimych producentów żywności oraz w laboratoriach akredytowanych i urzędowych.

Kwestie wykorzystania metody PCR w sektorze produkcyjnym regulują normy:

– PN-EN ISO 22174 Mikrobiologia żywności i pasz. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności. Ogólne wymagania i definicje.

Norma ta zwraca uwagę szczególną i definiuje różnorodne  kontrole, jakie musza być wykorzystywane na poszczególnych etapach oznaczania drobnoustrojów metodą Real-Time PCR. Dowiemy się z niej o wymaganej kontroli procesu, o dodatniej i ujemnej kontroli PCR, która sprawdza czystość naszej pracy oraz wewnętrznej kontroli reakcji PCR – bardzo istotnej z punktu widzenia wiarygodności wyniku ujemnego. Kontrola wewnętrzna reakcji PCR zapobiega wydawaniu wyników fałszywie ujemnych, które mogłyby wynikać z inhibicji powodowanej przez badaną próbkę.

Norma ta reguluje też kwestie organizacji poszczególnych stref pracy w laboratorium analityczny, tj. stref tzw. DNA„+” i DNA„-”. W oparciu o zapisy tej normy wspieramy naszych klientów na każdym etapie współpracy – również  na etapie projektowania układu pomieszczeń, wyposażenia podstawowego oraz niezbędnych urządzeń towarzyszących.

– PN-EN ISO 20837 Mikrobiologia żywności i  pasz. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności. Wymagania dotyczące przygotowania próbki do wykrywania metodami jakościowymi.

Ta norma zawiera ogólne zasady postępowania z próbką, zalecany sposób ekstrakcji DNA z próbki, w tym możliwość korzystania z gotowych zestawów odczynników, a wówczas – postepowanie zgodnie z instrukcją producenta danego testu.

– PN-EN ISO 20838  Mikrobiologia żywności i  pasz. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności. Wymagania dotyczące powielania (amplifikacji) i wykrywania metodami jakościowymi.

Ta norma znów zwraca uwagę na konieczność stosowania wielu kontroli podkreślając rolę kontroli wewnętrznej jako tej,  która udowadnia brak inhibicji reakcji PCR. Znajdziemy tu też zalecenia co do potwierdzania wyników pozytywnych uzyskanych w metodzie PCR oraz rekomendacje korzystania z odpowiedniego sprzętu pomocniczego-osobnych zestawów pipet dla różnych stref oraz zalecenie stosowania końcówek z filtrem do pipet automatycznych.

– PN-EN ISO 22118 Mikrobiologia żywności i  pasz. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności. Charakterystyka molekularnych metod wykrywania

Ta norma to zbiór definicji dotyczących walidacji metody czyli sposobów określenia czułości, specyficzności i wybiórczości dla metody.

– ISO 22119 Microbiology of food and animal feeding stuffs- Real Time polymerase chain reaction for detection of food-borne pathogens- General requirements and definitions

Powyższe normy opisują właściwy sposób wykorzystania metody PCR zarówno w zakładzie produkcyjnym jak i w laboratorium akredytowanym. Precyzują  jak wdrożyć, zwalidować i jak prawidłowo pracować z tą metodą.

My – jako zespół firmy Sterbios pomożemy w użytkownikowi w doborze odpowiedniej metodyki i sprzętu towarzyszącego, a przez czas korzystania z naszych rozwiązań będziemy służyć radą i szerokim doświadczeniem.

Zapraszamy do kontaktu 😊

Newsletter

Czekamy na Twoje pytania!
Poniższy formularz wyśle do nas wiadomość - skorzystaj!